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探析花色苷基因工程改良及其策略
摘要： 基因工程在植物花色改良中正發揮著越來越來重要的作用，綜述了植物花色苷基因工程所采用的方法和策略，包括花色苷生物合成基因的分離克隆、基因的遺傳轉化和基因工程改良的基本策略。關鍵詞： 花色；基因工程；花色苷；植物色素
利用基因工程改良花色是花卉分子育種的重要手段，不再受植物親緣關系的限制，花色改良的效果通過目測和少量輔助手段即可判斷[1]。花色苷是植物次生代謝過程中產生的黃酮類物質，它是花色素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，廣泛存在于植物各組織細胞的細胞液中，使植物呈現從紅、紫到藍等的不同顏色[2]。花色苷的生物合成途徑是被最為廣泛而深入研究的植物次生代謝途徑，特別在主要模式植物中，已經有了清楚的認識[3]。許多花色苷生物合成途徑中的關鍵酶基因和調節基因均已經從不同植物中克隆到[3，4]。轉基因花卉主要用于觀賞，易被公眾接受，具有傳統育種手段難以比擬的優越性，必將給花色改良帶來革命性的影響，已成為當前花卉育種研究的熱點。
1 花色苷生物合成基因的分離和克隆
植物花色苷基因工程改良遵循一般植物基因工程規律，了解特定色素生物合成途徑、克隆關鍵酶的基因是植物花色基因工程改良理論依據和前提。首先是花色苷生物合成途徑基因的克隆，第1個被分離的花色苷合成酶基因是CHS基因，它是從歐芹（Petroselinum cnispum）懸浮細胞用差異雜交分離到的[5]；以后利用轉座子標簽、PCR擴增、異源雜交、差異cDNA克隆、電子克隆、蛋白質純化與差異篩選等方法分離克隆到了多個花色苷生物合成相關基因。花色苷的生物合成是從莽草酸代謝途徑合成苯丙氨酸和脂肪酸合成代謝合成丙二酰CoA開始，經苯丙烷類途徑合成[6]。根據基因對花色苷生物合成的作用可分為結構基因和調節基因[7]。結構基因直接編碼花色苷生物合成途徑中的生物合成酶類，如PAL、4CL、CHS、CHI、F3H、DFR、F3′H、F3′5′H、ANS、3GT等基因；另一類是調節基因，它們調控花色苷生物合成基因的表達強度和模式，同時控制花色苷在時空上的變化，如AN1、AN2、JAFl3和AN11等[8]。
2 基因遺傳轉化的方法
基因轉化的主要方法有農桿菌介導法[9]、基因槍法 [10]、花粉管導入法[11]、化學試劑誘導法[12]和電穿孔法[13]等。
農桿菌介導的基因轉化方法是迄今最可靠、最有效的轉化方法。現在的轉基因再生植物中，80 %以上是用這種方法獲得的，主要有葉盤轉化法、整株感染法和原生質體轉化法[14]。
基因槍法又稱微彈轟擊法，是由康乃爾大學Sanford等[10]建立的基因導入方法，其基本原理是利用亞精胺、聚乙二醇的粘附作用將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細胞或組織。
花粉管通道法最早由周光宇提出[11]，其基本原則是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道使外源DNA 沿著花粉管進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞的方法。
化學誘導法[12]的主要原理就是聚乙二醇、多聚-L-鳥氨酸、磷酸鈣在pH值較高的條件下誘導原生質體攝取外源DNA分子。
電穿孔法又稱電激法，首先由Neumann提出[13]，是在高壓電脈沖作用下，在新鮮分離的原生質體的質膜上形成可逆性的瞬間通道，從而發生外源DNA 的攝取。
此外，還有脂質體轉化法、低能離子束法、病毒載體轉化法、轉座子介導法和浸泡法等。
3 花色苷基因工程改良的基本策略
花色苷合成由多個代謝步驟、多基因決定，所以利用基因工程改造花色苷一個重要策略就是還原法，即欲修飾某個性狀時，先要明確決定該性狀的特異生化物質，然后對形成該生化物質的代謝途徑進行基因工程操作。具體就是分析催化各反應步驟的酶、編碼這些酶的基因及其表達調控[15]。多步驟的代謝途徑有限速步驟，而限速步驟對整個代謝途徑起著決定性作用，所以對限速步驟的遺傳操作往往是還原法的重要突破口。增強某種關鍵酶的表達，往往可使花色苷合成途徑朝生成其催化產物的方向進行；而抑制該酶的表達，則會使反應朝合成途徑的另一分支進行，導致另一種產物的積累[16]。
3.1反義抑制法
利用基因工程技術進行花色苷修飾的常用方法是反義抑制法，首先明確決定花色苷的特異生化物質，然后分析該生化物質代謝途徑中催化各反應步驟的酶，克隆編碼這些酶的基因，反向轉入到目的植株中，外源DNA轉錄產物與內源的互補mRNA結合，而抑制目的植株中這些生化物質的合成[17]。利用該技術已在矮牽牛[17，18]、菊花[19-21]等幾種觀賞植物中進行成功了花色修飾。
3.2共抑制法
共抑制法，又稱正義抑制法，即正向導入1個或幾個內源基因的額外拷貝，反而抑制該內源基因轉錄產物mRNA的積累， 進而抑制該內源基因的表達[22，23]。該技術在矮牽牛[24]、菊花[19]、藍豬耳[25]等花卉的花色修飾方面已取得成功。
3.3導入調節基因
如果植物已具色素合成結構基因，只是因為組織特異性或缺乏調節基因表達產物的激活而不表達時，導入調節基因并使之適當表達可活化特定的結構基因， 改變花色。如Quattrocchio 等[26]將系列花色苷合成的調節基因轉入矮牽牛，獲得紅色的愈傷組織和粉紅色花色的轉化株。Kim[27]將玉米C1基因通過農桿菌介導轉入煙草，使株花瓣變狹長，顏色顯著變淺。
3.4導入新的外源基因
Meyer等[28]首次將源自玉米的編碼DQR的A1基因導入矮牽牛白花突變體中，產生了開磚紅色花的矮牽牛。1992年澳大利亞Calgene Pacific公司與日本Sundory公司合作向薔薇中導入F3′5′H基因獲得成功，同年該公司在矮牽牛中導入該基因獲得藍色矮牽牛[29]。此外，在花色基因工程操作中，也可以導入調節基因以增強或減弱原有代謝產物表達，或導入其他與花成色作用有關的基因，如pH基因、輔助色素基因、細胞形狀基因等，也可以同時導入與某種花色有關的多種基因。
4 植物花色苷基因工程改良的安全性
植物花色色素屬次生代謝產物，與植物防御系統相關。因此，基因工程改良花色可能妨礙植物的生存。同時，無法預測外源基因在轉基因植株遺傳背景中會產生的作用和后果[1]，在環境安全性方面存在潛在的威脅，如轉基因花卉雜草化、產生對人類有害的代謝物、因基因