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探析HCV檢測現(xiàn)狀及新進(jìn)展
摘要： 丙肝是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一，主要通過血液傳染。我國平均感染率為3.2%。北方稍高，約為4.6%，南方為2.6%～2.9%，感染人數(shù)估計有3700萬。受感染的母親傳播給嬰兒的發(fā)生率為5%。患急性肝炎后約有50%～70%的感染者有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的傾向，重者20～25年后可轉(zhuǎn)化為肝硬化，肝硬化患者10年內(nèi)有大約30%的發(fā)展為終末期肝病[1-2]，并且HCV感染與原發(fā)性肝細(xì)胞癌有較密切的關(guān)系。對于HCV感染者，第3、5、7、10年的肝癌累積發(fā)生率達(dá)11%、18.1%、29%、45.6% [3]。隨著醫(yī)學(xué)檢驗的迅猛發(fā)展，HCV檢測技術(shù)也不斷提高．但與檢測乙型肝炎病毒（HBV）相比，HCV的檢測還有許多難題有待解決。關(guān)鍵詞： HCV 抗–HCV RNA ELISA RT-PCR
HCV檢測目前存在的主要問題有：1.由于HCV抗原結(jié)構(gòu)的特殊性，直接檢測血清中HCV抗原的技術(shù)問題還未徹底解決。2.抗體（抗－HCV）出現(xiàn)時間晚，從HCV感染后到抗體轉(zhuǎn)陽的時間平均為50～70天，有的患者可延長至6～9個月，檢測的“窗口期”較長。3.病毒基因型復(fù)雜而且容易變異，使基因水平的檢測質(zhì)量不夠穩(wěn)定。隨著有關(guān)人員近年來的不斷努力和相關(guān)科學(xué)的迅猛發(fā)展，已經(jīng)在HCV檢測技術(shù)方面有了重要進(jìn)展。
1 第三代抗－HCV試劑的應(yīng)用
檢測丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）仍是目前常用手段，這方面的檢測方法主要是第三代酶免疫測定法（EIA）或間接酶免疫法（ELISA），我國大多采用ELISA方法。
ELISA方法中包被抗原的組成和質(zhì)量是關(guān)鍵因素。第三代ELISA試劑比第一、第二代試劑有明顯的改進(jìn)，其包被的抗原為HCV核心抗原NS3、NS4和NS5。由于第一、第二代試劑的重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以都存在抗－SOD造成的假陽性。而第三代HCV試劑，用中國北方地區(qū)HCV全基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)開發(fā)的預(yù)測蛋白理化性質(zhì)及三級結(jié)構(gòu)和抗原決定簇的位點的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性﹑親近性﹑移動性分析，已預(yù)測到HCV抗原決定簇的位點。第三代試劑的特異性達(dá)到99%[4]。抗－HCV檢測可成為丙型肝炎病毒早期感染的檢測指標(biāo)[5]。
HCV感染通常是持續(xù)的終生感染。雖然第三代HCV抗體ELISA試劑增加了HCV Ns5區(qū)表達(dá)的蛋白作為抗原，提高了試劑敏感性，HCV感染的“窗口期”通常還需要平均40多天。因此，第三代ELISA試劑仍需要提高和改進(jìn)，例如在篩查試驗的特異性方面，仍存在假陽性結(jié)果。對強陽性或弱陽性樣本的檢測，國產(chǎn)試劑（主要廠家）的s/co值高于進(jìn)口試劑，但是無論對陽性及陰性樣本檢測，國產(chǎn)試劑的CV值及特異性均明顯低于進(jìn)口試劑，以致出現(xiàn)更多的假陽性結(jié)果。此外，丙肝抗體酶免試劑皆沒有灰區(qū)的設(shè)定，s/co比值較低（但大于１）的結(jié)果也報告陽性，亦是假陽性比較多的原因。[6]
2 丙型肝炎病毒抗原檢測方法的建立
多年來，專業(yè)人員一直探索能夠直接檢測HCV抗原，以達(dá)到縮短窗口期的目的。但是由于HCV抗原的特殊性和相關(guān)抗體制備中存在的困難，使這方面的進(jìn)展受到阻礙。
2.1 HCV核心抗原檢測
HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標(biāo)，幾乎與HCV RNA同時出現(xiàn)，核心抗原和HCV RNA的動力學(xué)變化密切相關(guān)。
HCV核心抗原檢測用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中的HCV核心抗原，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后獲得的純抗HCV核心抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標(biāo)記物，與血清中的HCV核心抗原反應(yīng)，OPD顯色后進(jìn)行定性或定量測定。該方法不受被檢測樣品中抗-HCV的干擾，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。可用于HCV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析[7]。
有報道，HCV-CAg檢測可以較HCV抗體檢出時間提早23～46d[8]，且EIA法較PCR法簡便、快速，現(xiàn)有能力開展ELISA檢測的實驗室無需增加特殊設(shè)備，均可檢測。其結(jié)果與RT-PCR方法的復(fù)合率為85.71%。因此，在不具備RNA檢測條件的實驗室開展HCV-CAg檢測時很好的篩查方法。有報道，在對180例抗-HCV陰性患者的篩查中，檢出HCV－CAg陽性2例，表明僅用抗－HCV檢測將有可能存在0.55%感染者漏診的風(fēng)險，尤其是對手術(shù)前丙肝病毒篩查的病例，它涉及到術(shù)中感染責(zé)任和用血安全等問題。丙肝核心抗原檢測在一定程度上降低了這些風(fēng)險。因此,丙肝核心抗原檢測可作為HCV抗體檢測的補充試劑。
2.2 HCV抗原檢測
十幾年來，一些學(xué)者曾經(jīng)試圖建立血清中各種HCV抗原的檢測方法，但由于血液中HCV抗原含量太低，用常規(guī)方法無法檢測出。近年來，由于HCV單克隆抗體的研究成功，已有國內(nèi)外學(xué)者發(fā)表了肝組織及人體分泌物中HCV抗原檢測成功的報導(dǎo)。如果能加強對HCV中和抗體Wv、抗-HCV-IgM、抗-HCV核心抗體的研究[9]，進(jìn)一步開發(fā)對血清及肝組織內(nèi)HCV抗原的測定，可能會在丙肝的實驗診斷方面取得更大進(jìn)展。
3 丙型肝炎病毒RNA的檢測
現(xiàn)在用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測血清中的HCV RNA。基本原理是首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用，在特異性
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