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腦缺血與凋亡相關(guān)基因的變化
畢業(yè)論文腦缺血與凋亡相關(guān)基因的變化
曹陽
廣州市紅10字會醫(yī)院
1般認為,腦損傷引起的急性期神經(jīng)元死亡是以壞死為主,而繼發(fā)死亡或遲發(fā)死亡則以凋亡為主,
大約有50%的細胞死亡是由凋亡引起.前者發(fā)生在缺血后早期的中心區(qū),后者多發(fā)生在缺血后的半影
區(qū).細胞的凋亡與壞死其本質(zhì)區(qū)別在于凋亡是1種主動死亡過程,伴隨基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成,特征
性變化是DNA的寡核小體間裂解,在凝膠電泳時呈現(xiàn)特征性的"DNA梯".細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特點是
細胞核染色質(zhì)固縮,細胞膜發(fā)泡,細胞器緊縮,凋亡小體形成與呈現(xiàn)"DNA階梯"電泳圖譜.
細胞凋亡是機體在內(nèi)外環(huán)境刺激下,啟動自身機制,由基因調(diào)控的細胞死亡過程,需新的mRNA
表達和蛋白質(zhì)合成過程.細胞凋亡是1個瀑布式基因表達過程,許多基因包括原癌基因與抑癌基因均
參與細胞凋亡的調(diào)控,細胞凋亡過程中涉及某些基因的活化,并且受基因密碼的調(diào)控,因此有人將此
種由遺傳因素決定的細胞凋亡的基因稱為"凋亡基因".
研究資料顯示在腦缺血損傷中,神經(jīng)元凋亡受到1系列基因的調(diào)控,腦缺血后有多種基因表達,
并編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物介導(dǎo)凋亡的調(diào)控,包括促進凋亡的Bax,Bcl-xS,Caspases家族,NFκB,P53,Fas/Fasl
等,以及抑制凋亡的Bcl-2,Bcl-xL,HSP,cFos,sFas等等.
2,研究較多的凋亡相關(guān)基因家族
1 半胱天冬酶Caspases家族
半胱天冬酶Caspases家族屬于半胱氨酸蛋白酶家族.目前研究較明確的Caspase家族成員有10
余個.主要分為2大類,1是調(diào)控細胞因子成熟,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的白介素-1轉(zhuǎn)換酶(interleukin-1
cinverting enzyme)家族,如Caspase-1,4,5,11,12及14,等,另1類是直接參與凋亡的Caspase-2,
3,6,7,8,9等.進1步可以分為起始 Caspases(initiator caspases)和效應(yīng)Caspases(effector Caspases),
起始 Caspases有1個較長的前區(qū),與位于跨膜和胞內(nèi)觸發(fā)凋亡的蛋白質(zhì)的死亡結(jié)構(gòu)域(the death
domains,DDs)起反應(yīng),并通過這1反應(yīng)將1系列凋亡前刺激物激活,并使之具有蛋白分解活性;而
效應(yīng)Caspases有1個短的前區(qū),直接參與細胞內(nèi)底物分裂,導(dǎo)致凋亡細胞形態(tài)學(xué)和生化特征改變.大
量證據(jù)表明腦缺血可以激活Caspases.神經(jīng)元發(fā)生凋亡時Caspase-9被激活,并將 procaspase-3裂解,
產(chǎn)生具活性Caspase-3,進而酶解切割特異性底物PRAP [poly (ADP-ribose) polymerase],DNA依賴性
蛋白激酶(DNA-PK),類固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREPB)等.許多研究表明,Caspase-3是關(guān)鍵蛋
白酶,處于級聯(lián)反應(yīng)的核心位置并發(fā)揮重要作用,被稱為死亡蛋白酶.在實驗性大鼠短暫性半球和全
腦缺血模型中,在神經(jīng)細胞死亡之前就可以觀察到Caspase-3 mRNA的上調(diào)和蛋白質(zhì)激活,尤其是海
馬和尾狀核部位.
研究報道大鼠短暫全腦缺血可導(dǎo)致Caspase-3介導(dǎo)的ICAD(inhibitor of caspase-activated
deoxyribonu- clease)的分裂,產(chǎn)生CAD(caspase-activated deoxyribonuclease),進而DNA被CAD降
解,產(chǎn)生凋亡.相關(guān)報道大鼠短暫MCAO時,DNA酶活性可被具有抑制 Caspase-3活性的類似物所
抑制.研究表明持續(xù)性局灶性腦缺血,可有Caspase前體(Caspase-3,6,8)的mRNA和蛋白質(zhì)水平
的增加,以及Caspase-3,8激活和PARP的分裂.大鼠腦室內(nèi)注射選擇性Caspase阻滯劑2-DEVD-fmk
后,可減少細胞凋亡,具有神經(jīng)保護作用.這表明 Caspase-3是促進腦缺血后神經(jīng)元凋亡的1個重要
因素.另有報道動脈血栓栓塞性腦卒中患者發(fā)病數(shù)小時內(nèi),procaspase-3的水平有增加,但活性
Caspase-3和PARP碎片并未有明顯增加.在患者發(fā)生心臟缺血再灌注幾天后,在部分神經(jīng)元細胞內(nèi)可
以檢測到Caspase-3和89-kD的PARP分裂產(chǎn)物,表明Caspase-3可以導(dǎo)致神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡.
2 Bcl-2基因家族
Bcl-2 是從濾泡性淋巴細胞瘤中分離出來的1種癌基因.Bcl-2 家族可以分為3組.第1組包括
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Bcl-2,Bcl-xL,A1/Bfl1,Boo/Diva,Bcl-w,Mcl-1及Nrf-3,均含有4個與 Bcl-2相同的區(qū)域(BH1-4),
即含有1個疏水的C末端,通過它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng),核膜及線粒體外膜相連.第2和第3組則是凋亡前體(pro-
apoptotic),第2組C末端或者是缺乏BH4區(qū) (Bax,Bak,Bok/Mtd)或者是具有BH4區(qū),但缺乏BH1
和BH2區(qū)(Bcl-xS),第3組包括Bad,Bid,Bik/Nbk,Bim/Bod,Blk,Hrk,Nix,Bnip3,Noxa和
PUMA,只含有1個BH3區(qū).Bcl-2在進化過程中高度保守,功能也相對保守,它通過阻斷細胞凋亡
而促進細胞存活,維持細胞生存,而Bax與Bcl-2功能相反,誘導(dǎo)細胞凋亡.Bcl-2和Bax 的表達強
度決定細胞命運,Bax占優(yōu)勢時促進細胞死亡,Bcl-2占優(yōu)勢時阻止細胞死亡).Bcl-2抑制細胞凋亡的
機制可能在于其與凋亡促進基因Bax拮抗,抑制細胞色素C自線粒體釋放至細胞質(zhì),阻止胞質(zhì)內(nèi)細胞
色素C對Caspase蛋白酶的激活,從而抑制凋亡.
研究發(fā)現(xiàn),Bax基因是P53的下游基因,它單獨不足以啟動細胞凋亡途徑,多與Bcl-2,P53共同
參與并調(diào)節(jié)細胞凋亡,其作用具有2重性,Bax不僅能和Bcl-2形成2聚體(Bcl-2-Bax)抑制凋亡,
而且其自身還能形成2聚體(Bax-Bax)誘導(dǎo)凋亡.Bcl-x有兩種基因產(chǎn)物Bcl-xL和Bcl-xS,Bcl-xL
抑制凋亡,Bcl-xS拮抗Bcl-2和Bcl-xL的功能,促進細胞凋亡,兩者在凋亡調(diào)控中的確切作用機制與
Bcl-2的關(guān)系尚未完全闡明.Bcl-2選擇性與Bcl-xL2聚體,使得其與Bcl-2的親和力變小,代替Bax
調(diào)節(jié)Bcl-xL的抗凋亡作用.
動物實驗表明,短暫性局灶性腦缺血后20min海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達開始升高,3天達峰值,
可持續(xù)7天.而在腦缺血后神經(jīng)元細胞死亡之前,會出現(xiàn)Bax水平增高,同時在短暫性局灶性腦缺血
發(fā)生時,Bax可快速由胞漿轉(zhuǎn)移至線粒體,與線粒體的腺嘌呤核甘酸異位子及電壓依賴的陰離子通道
反應(yīng),促進細胞凋亡.在缺血再灌注損傷的動物模型中,Bcl-2過度表達可減少神經(jīng)細胞凋亡,并可預(yù)
防海馬CA1區(qū)齒狀顆粒細胞凋亡.而另1方面,敲除Bcl-2基因,則神經(jīng)功能缺失增加,梗死面積擴
大.總之,在Bcl-2家族中,抑制凋亡組有Bcl-2,Bcl-xL,促進凋亡組有Bax,Bcl-xS,Bad等.
3 核轉(zhuǎn)錄因子NFκB
NFκB最初發(fā)現(xiàn)于B淋巴細胞,與免疫球蛋白的κ輕鏈基因增強子的B位點結(jié)合,調(diào)控免疫球
蛋白的κ輕鏈的轉(zhuǎn)錄,NFκB的活化受 IκB(inhibitor-κ-binding)調(diào)節(jié),NFκB根據(jù)其活化狀態(tài)分
為誘導(dǎo)型和結(jié)構(gòu)型,誘導(dǎo)型指在 NFκB非活化狀態(tài)下,與其抑制蛋白IκB結(jié)合,存在于細胞質(zhì)內(nèi);
結(jié)構(gòu)型是指活化后在核內(nèi)無IκB,能與DNA結(jié)合的形式.NFκB在CNS中廣泛存在,可見于大腦
皮質(zhì),海馬和小腦突觸上,神經(jīng)元,神經(jīng)膠質(zhì)細胞與血管內(nèi)皮細胞均可表達,與CNS的信號傳導(dǎo)有關(guān).
NFκB是各種炎癥因子的中間調(diào)控環(huán)節(jié),在凋亡中的作用較為復(fù)雜,過度的表達導(dǎo)致各種損傷,完全
不表達則不利于自身保護.研究表明,24h內(nèi)的1過性NFκB活化,誘導(dǎo)神經(jīng)元保護因子的表達,保
護缺血性腦損傷,而在海馬神經(jīng)元中的持續(xù)表達,可促使海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡.
4熱休克蛋白(heatshockprotein, HSP)
HSP是機體應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的1組特殊蛋白質(zhì).目前證實約有2百余種因素能刺激HSP的產(chǎn)生,
故又稱應(yīng)激蛋白.HSP 主要功能是提高細胞對應(yīng)激因素的耐受,維持細胞蛋白自穩(wěn),使細胞維持正常
的生理功能.研究較多的有 HSP70,HSP110, HSP72,HSP60等.研究發(fā)現(xiàn),短暫腦缺血后,HSP70
等在腦缺血區(qū)明顯升高,其早期表達是細胞耐受缺血性損害的原因之1.其作用機制可能是依賴ATP
恢復(fù)正常核糖體裝配,促進新核糖體的合成及加速細胞核形態(tài)的恢復(fù).
5 P53基因
P53 是促進細胞凋亡的重要基因,它通過激活1系列下游基因發(fā)揮促凋亡作用.P53作為1種抑
癌基因,其蛋白產(chǎn)物有野生型 (wt-P53)和突變型(mt-P53)兩種.mt-P53至今為止只在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn),
與細胞的異常增殖有關(guān);wt-P53作為1種抗細胞增殖蛋白,可誘導(dǎo)腫瘤細胞和神經(jīng)元凋亡.另外,wt-P53
作為1種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)其他細胞周期相關(guān)基因,如p21基因,Bax基因的表達,同時降低Bcl-2
的表達,加速細胞凋亡.研究發(fā)現(xiàn):大鼠大腦中動脈閉塞2h,再灌注6h時,神經(jīng)元開始出現(xiàn)P53表
達,于再灌注12達高峰,隨后下降,蛋白表達位于神經(jīng)元嚴重受損的區(qū)域.
6 Fas/Fasl
Fas是人們在研究膜蛋白抗體的溶細胞作用時被發(fā)現(xiàn),進而從細胞毒T細胞系分離了Fas 的配體
(Fas ligand,Fasl),從而建立了 Fas/Fasl細胞凋亡信息傳遞系統(tǒng).結(jié)構(gòu)分析證實Fas是I型跨膜蛋白,
分子量45KD,屬腫瘤壞死因子(TNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)受體家族.Fasl是1種分子量約40KD
的II型跨膜蛋白,屬TNT家族成員.Fas含死亡結(jié)構(gòu)域(DDs),與Fas 發(fā)生反應(yīng)的蛋白是 Fas 死亡
結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(Fas associated death domains,FADD),Fas與FADD通過DDs形成2聚體而相互作用.
FADD N末端稱為死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effector domain),該結(jié)構(gòu)負責(zé)將凋亡信號傳遞至Caspase-8,
使之活化,從而啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng),細胞產(chǎn)生凋亡 .研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)局灶性腦缺血可誘導(dǎo)Fas編
碼基因變異形成了sFas,其缺乏跨膜蛋白,sFas與Fas競爭結(jié)合Fasl,Fas與可溶性Fasl(sFasl)結(jié)合,
發(fā)出凋亡信號,并傳遞至細胞核內(nèi),調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)靶細胞凋亡;而sFas缺乏跨膜蛋白的死亡結(jié)
構(gòu)域(DDs),不具生物活性,sFas與Fasl結(jié)合后,信號無法通過細胞膜傳遞至胞內(nèi),從而抑制凋亡.
7 立早基因(immediateearlygenes,IEGs)C-fos與C-jun
IEGs是腦缺血后快速而短暫表達的1簇基因的統(tǒng)稱,現(xiàn)研究較多的有c-fos和c-jun家族.c-fos
和c-jun表達的蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,通過形成2聚體的形式結(jié)合在靶基因的DNA相關(guān)序列即AP-1
位點,影響靶基因的表達,參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo).c-fos在腦缺血中是起保護還是損傷作用1直有爭議.有實
驗表明N-乙酰基-O-甲基多巴胺(N-acety-O-methyldopamine,NAMDA)在缺血刺激下能上調(diào)c-fos的表
達,CA1神經(jīng)元c-fos的早期表達增加能上調(diào)存活基因的表達而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用.局部腦缺血后,
C-fos蛋白通過上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護作用,抑制C-fos蛋白的表達能使腦梗面積增大.也有
實驗表明局部腦缺血能誘導(dǎo)大腦皮質(zhì)中C-fos和C-jun蛋白的大量生成,且與神經(jīng)功能的缺陷程度成正
相關(guān).使用血管緊張素受體拮抗劑能降低腦中C-fos和C-jun蛋白的表達,改善腦缺血損傷的恢復(fù).
C-fos與C-jun均為原癌基因,正常情況下,C-fos與C-jun在神經(jīng)元中僅呈極低水平表達,而腦缺
血與再灌注后即被快速而短暫地誘導(dǎo)表達.研究表明,大鼠大腦中動脈阻斷1h后,C-fos與C-jun mRNA
表達開始升高,主要位于半暗帶區(qū)和梗死周邊的正常組織.其促凋亡的機制可能為:其產(chǎn)物fos,jun
經(jīng)亮氨酸拉鏈,聯(lián)合為雜合2聚體,即轉(zhuǎn)錄因子AP1,特異性與DNA上AP1結(jié)合位點結(jié)合而啟動晚
期效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄,從而促進凋亡.也有學(xué)者認為C-fos 的表達具有神經(jīng)保護作用.在腦缺血研究中
發(fā)現(xiàn),將形成梗死灶的缺血中心區(qū)C-fos不表達或輕微表達,而半暗區(qū)C-fos表達明顯.全腦缺血中,
能耐受缺血的齒狀回C-fos表達最快,最明顯,而海馬區(qū)(尤其CA1區(qū))表達弱且延遲,說明其早期表
達對缺血后細胞的存活具重要神經(jīng)保護作用.
3,展望
腦缺血后神經(jīng)元凋亡受1系列基因調(diào)控.神經(jīng)元凋亡可能是通過啟動細胞自身內(nèi)部的死亡機制發(fā)
生的.我們前期研了大鼠腦缺血再灌注后Fas,TNFR1,p53,c-Myc,P-ERK,P-p38等在海馬區(qū)的表達
及Bcl-2過度表達對其的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注后,Fas,TNFR1,p53,c-myc,P-p38
蛋白在海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)均有表達,但CA1區(qū)強于CA3區(qū);P-ERK在CA1區(qū)及CA3區(qū)亦均有表達,
但CA1區(qū)弱于CA3區(qū);Bcl-2基因過度表達可明顯減弱Fas,TNFR1,p53,c-myc,P-p38蛋白的表達,
增強P-ERK蛋白的表達,說明Bcl-2除主要通過線粒體內(nèi)在途徑發(fā)揮其抑凋亡作用外,還通過其他途
徑如死亡受體外在途徑(TNFR1,Fas)及DNA損傷機制等抑制凋亡.
目前有關(guān)腦缺血后神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因的表達研究越來越多且漸趨深入,隨著對凋亡基因研究的
深入及對凋亡機制的闡明,用干預(yù)基因表達的方法治療腦缺血是可以預(yù)見的具有潛力和突破性的手段.
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