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脂肪源干細胞上皮分化淺說在喉組織工程中的應用
脂肪源干細胞上皮分化在喉組織工程中的應用
聲帶瘢痕是一個較難解決的臨床問題，尚缺乏有效的治療手段，目前其主要的治療方法是向聲帶中注射填充物或細胞，試圖恢復聲帶淺層的振動性。聲帶振動受損主要是由于固有層細胞外基質的中斷、膠原沉積增多、彈性纖維的丟失等引起。有證據表明聲帶注射細胞或基質對恢復聲帶黏膜波的作用是有限的。另外，從人的聲帶中獲取成纖維細胞比較困難。現有的組織工程方法是將聲帶的成纖維細胞包被在一系列的支架上。用自體細胞來源的組織結構工程代替聲帶被覆黏膜可能成為嚴重聲帶瘢痕的治療方式。實現該目標的第一步是構建類似于聲帶固有層和上皮層的三維細胞群基質。切除聲帶瘢痕后，用新的有組織結構的細胞外基質和上皮作為替代物，改善聲帶的振動功能。
本研究便是介紹一種新的組織工程方法來構建聲帶被覆黏膜的替代物，以便恢復聲帶固有層和上皮的振動功能。通過脂肪抽吸分離獲得的脂肪源干細胞是一種多功能干細胞，作為一種自體間質細胞的來源，已被廣泛用來產生軟骨細胞、成骨細胞和纖維細胞。脂肪源干細胞與骨髓源間質干細胞具有相似的遺傳特征，可以分化成外胚層和內胚層細胞。本研究假設脂肪源干細胞在氣體界面和特異性細胞因子的作用下可以分化成上皮細胞，而遠離氣體界面的細胞則可以分化為成纖維細胞。其方法是從UCLA血庫獲取冷沉淀物，一7O℃保存備用。將解凍的冷沉淀物、牛凝血酶溶液以及細胞懸液按4：1：1混合形成纖維蛋白一脂肪來源的干細胞膠。在Transwell培養基板上形成凝膠，將一定量的細胞懸液直接加在膠上形成氣體界面。
可見在特定的生長因子和氣體界面的培養下，整個三維培養基中可見膠原產生，在接近上皮層的細胞中膠原沉積較多；在表皮生長因子和氣體界面培養下，E一鈣黏蛋白(一種上皮細胞標志物)在三維培養基中陽性表達；在表皮生長因子和氣體界面下培養8天后，培養基表面的細胞中細胞角蛋白呈陽性表達；在表皮生長因子的作用下培養14天后，接近氣膠交界的細胞會出現較多的E一鈣黏蛋白表達，包埋在基質中的細胞則無E一鈣黏蛋白的表達，而波形蛋白陽性表達較明顯。波形蛋白是一種在間質細胞系中表達的細胞骨架蛋白，聲帶固有層中的成纖維細胞陽性表達波形蛋白。在三維培養基中表達波形蛋白的細胞位于表達E一鈣黏蛋白細胞的深層。
本研究構建了聲帶黏膜的組織工程替代物，三維的纖維蛋白和脂肪源干細胞的水凝膠與聲帶的固有層和黏膜層有著相似的顯微結構和特性。在本研究中，成人脂肪源干細胞可以雙向分化成上皮細胞和間質細胞系，并且具有組織結構，表皮生長因子和氣體界面是上皮分化的必備條件。本研究結果初步表明，利用組織工程制作聲帶替代物是可行的。
應用肝細胞生長因子凝膠修復慢性聲帶瘢痕
慢性聲帶瘢痕(chronic vocal fold scar)一般繼發于喉部創傷、炎癥或者手術之后，由于聲帶固有層組織結構破壞而使聲帶生物力學功能發生改變，可導致聲門功能障礙和嚴重的發聲困難。以往組織學研究發現，聲帶瘢痕存在細胞外組織結構的改變，如：I型膠原沉積物密集或者紊亂，彈性蛋白和核心蛋白多糖減少，纖連蛋白增加以及透明質酸(hyaluronic acid，HA)降低等。這些組織學變化說明慢性聲帶瘢痕中成纖維細胞的表型合成異常，從而導致聲帶組織僵硬，因此，若使聲帶瘢痕恢復振動功能，改變纖維母細胞的表型以及修復細胞外基質結構是必需的。
肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多功能的多肽，其在胚胎形成、血管生成、器官重建和創傷修復方面起重要作用。HGF具有抗纖維化功能，在動物模型的研究中已證實其對肝、腎、肺的纖維組織具有預防纖維化及溶解纖維組織的作用。另有研究表明HGF具有治療聲帶瘢痕的作用，其可增加成纖維細胞中透明質酸的產生并降低膠原沉積。
以往研究表明HGF對聲帶急性損傷具治療作用，但存在HGF在聲帶注射位點擴散過快、存留時間太短的缺點。本研究建立一種新型的凝膠藥物釋放系統(drug deliverysystem，DDs)以減緩HGF在聲帶內的釋放、擴散，并通過犬動物模型觀察HGF—DDS對慢性聲帶瘢痕的修復作用。
實驗用水凝膠由戊二醛和酸明膠交聯化學反應而獲得，將1 gg的HGF加入水凝膠中制備成HGF水凝膠。選用8只米格犬作為實驗對象，在直達喉鏡下將一側聲帶固有層撕剝達肌層使聲帶瘢痕化，對側聲帶作為正常對照。6個月后，將0．5 ml HGF水凝膠(含HGF 1 ug)液通過經口聲帶注射器注入實驗組4只犬的瘢痕聲帶上皮下(HGF治療組)；另將0．5 ml PBS水凝膠液(含PBS 1 g)注入另四只狗的瘢痕側聲帶內(對照組)，1個月后再注射1次以強化療效。
術后9個月所有犬安樂死，取喉體進行聲帶振動檢測及組織學檢查。應用壓力傳感器檢測聲門下壓力，通過高速數字圖像系統記錄聲帶振動狀態，以發聲壓力閾值(pho—nation threshold pressure，PTP)評估聲帶黏膜振動，并經公式計算振幅率(amplitude ratio，AR)及標準聲門間隙(normalizedglottal gap，NGG)。光學顯微鏡下觀察每側聲帶固有層膠原、彈性蛋白及透明質酸，通過檢測固有層厚度判斷瘢痕收縮程度。
振動學檢查結果表明：HGF治療組聲帶黏膜振動明顯好于對照組，對照組損傷側聲帶呈弓形并且黏膜振動受限。
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