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對兩種凝血酶原提取方法的比較
摘要： 目的 比較等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原的純度。方法 分別采用等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原，凝血酶原經(jīng)單獨鈣離子激活得到凝血酶，通過凝血酶效價測定、蛋白質(zhì)濃度測定，計算出凝血酶的比活性。結(jié)果 采用等電點沉淀法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為11.01±1.54 U/mg，采用檸檬酸鋇吸附法提取的凝血酶原經(jīng)激活后得到的凝血酶比活性為130.17±12.30 U/mg，經(jīng)配對T檢驗，P＜0.01.結(jié)論 與等電點沉淀法相比，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取得到的凝血酶原純度更高。關(guān)鍵詞： 凝血酶原； 凝血酶； 等電點沉淀法； 檸檬酸鋇吸附法
凝血酶是參與機體凝血過程的一個重要的凝血因子，在體內(nèi)以凝血酶原形式存在［1］。20世紀中期開始人們將凝血酶應(yīng)用于臨床，由于其療效顯著，應(yīng)用也越來越廣泛。之后美英日等國從牛血漿中分離出凝血酶應(yīng)用于臨床，并證明將動物凝血酶應(yīng)用于人體未出現(xiàn)凝血酶抗原性，口服和局部外用時無過敏反應(yīng)和其他不良反應(yīng)等，因而目前所使用的凝血酶制劑大多來源于動物血漿，國內(nèi)采用豬血漿制備凝血酶的報道較多［2］。等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法是兩種主要的凝血酶原提取方法［3］，凝血酶原經(jīng)單獨的鈣離子激活可得到凝血酶。目前，國內(nèi)尚無研究比較應(yīng)用等電點沉淀法和檸檬酸鋇吸附法所得到的凝血酶原純度的差異，哪種方法得到的凝血酶原純度更高？更適合用于提取凝血酶原?本文對這兩種方法從豬血漿中提取凝血酶原的純度進行了比較。為相關(guān)實驗中選擇合適的凝血酶原提取方法提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
檸檬酸鈉抗凝的新鮮豬血漿。
1.2 主要試劑
纖維蛋白原和凝血酶標準品購自美國SIGMA公司，Bradford蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自美國Bio?Rad。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
檸檬酸鋇吸附法使用的四種溶液分別為，溶液A：1.0 mol/L BaCl2溶液； 溶液B：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L BaCl2，0.10 mol/L NaCl，pH7.4； 溶液C：0.02 mol/L Tris， 0.10 mol/L NaCl，0.20 mol/L Na2EDTA，pH7.4； 溶液D：0.02 mol/L Tris，0.15 mol/L NaCl，pH6.5.
1.3 主要儀器
GE GeneQuant 1300核酸蛋白分析儀。
1.4 方法
1.4.1 凝血酶原提取 將收集到的5份豬血漿按1～5編號，各均分為2份，其中1份采用等電點沉淀法提取凝血酶原，另1份采用檸檬酸鋇吸附法提取凝血酶原。
1.4.1.1 等電點沉淀法 豬血漿用蒸餾水稀釋10倍，用5 %冰乙酸將其pH調(diào)至5.3，4℃靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，過濾備用。
1.4.1.2 檸檬酸鋇吸附法 豬血漿中加入溶液A，體積比為10∶1，4℃攪拌30 min，靜置30 min后，3 000 r/min離心30 min，棄上清。沉淀用溶液B洗滌，3 000 r/min離心15 min，棄上清。重復(fù)洗3次。沉淀用溶液C解吸附，4℃攪拌0.5～1h，3 000 r/min離心15 min取上清。上清液用溶液D于4℃透析過夜。3 000 r/min離心15 min取上清液，即為凝血酶原溶液。
1.4.2 凝血酶原激活 用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，加入0.25 mol/L CaCl2溶液，使Ca2 終濃度為0.03 mol/L，再用2 % Na2CO3溶液將凝血酶原溶液的pH調(diào)至7.1，室溫靜置2 h，過濾即得凝血酶溶液。
1.4.3 凝血酶比活性測定 根據(jù)文獻［4］提供的方法配制0.1 %纖維蛋白原溶液。
凝血酶效價測定［4,5］：取凝血酶標準品，用生理鹽水配制成效價(U/mL)分別為5、6、7、8、9、10的標準品溶液。另取1×10 cm的塑料試管6支，各加入0.1 %纖維蛋白原溶液450 μl，置37℃水浴預(yù)熱5 min，再分別取已37℃預(yù)熱的上述6個濃度的標準品溶液各50 μl，迅速加入上述各試管中，立即計時并搖勻，記錄凝固時間。每個濃度測2次，求平均值，做標準曲線。待測樣品用生理鹽水稀釋適當濃度，取50 μl，按標準曲線的測定方法平行測定2次，求平均值，根據(jù)標準曲線或回歸方程計算樣品的效價。
根據(jù)文獻［6］，采用Bradford法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度，以牛血清白蛋白為標準品，每個樣本平行測2次，取平均值。根據(jù)公式：酶比活性=酶效價/溶液蛋白質(zhì)濃度，計算凝血酶溶液的比活性。
2 結(jié)果與分析
以凝血酶標準品溶液效價 (U/mL)為X，對應(yīng)的凝固時間（sec）為Y進行直線回歸處理，并求得直線回歸方程，所得方程式為：Y=62.913?5.994X，r≈0.994 8.將凝血酶樣品的凝固時間代入回歸方程，即可計算得出樣品的凝血酶效價(見表1、圖1)。
采用等電點沉淀法得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性為11.01±1.54 U/mg，而采用檸檬酸鋇吸附法提取得到的凝血酶原經(jīng)激活后，凝血酶的比活性可達到130.17±12.30 U/mg。其比活性經(jīng)配對樣本t檢驗統(tǒng)計學(xué)分析后，其概率P=3.54×10?5＜0.01，說明兩種方法得到的凝血酶比活性有顯著性差異，后者約為前者的11.8倍。從兩種方法所得到的凝血酶溶液的酶活性和蛋白質(zhì)濃度分析，造成兩者酶比活性差異的主要原因在于凝血酶的純度差異，凝血酶純度越高，比活性就越高。等電點沉淀法提取的凝血酶原溶液含雜蛋白較多，需要進一步純化，以提高酶的比活性。因而，采用檸檬酸鋇吸附法從豬血漿中提取凝血酶原大大優(yōu)于等電點沉淀法，得到的凝血酶純度較高。
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