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瘢痕成纖維細(xì)胞的鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)研究
目的 觀察鈣網(wǎng)蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。方法 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和原位ELISA技術(shù)對(duì)體外培養(yǎng)的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行CRT分布定位及表達(dá)水平研究。結(jié)果 瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞在處于增殖生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)，胞漿及核內(nèi)均有不同程度的CRT表達(dá)，其中瘢痕成纖維細(xì)胞表達(dá)CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞水平(A:1.43±0.12),差異有非常顯著意義(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)則均無(wú)CRT表達(dá)。結(jié)論 瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)CRT的豐富表達(dá)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞遷移、信號(hào)傳遞及鈣存儲(chǔ)等方面均有著積極作用。Studyontheexpressionofcalreticulininhypertrophicscar-derivedfibroblasts
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionlevelandintracellulardistributionofcalreticulin(CRT)inhypertrophicscar-derivedfibroblasts(HSF)andnormalskin-derivedfibroblasts(NSF).MethodsUsinganti-CRTantibody,CRTwasdetectedinHSFandNSFbyimmunocytochemistryandELISAtechnique.ResultsCRTwaspresentinthecytoplasmandnucleiinproliferatingHSForNSFinculture,butHSFpossessedsignificantlyhigherexpressionlevelofCRTthanNSF(P＜0.01).Whenthesecells(HSFandNSF)werefused,neitherintracellularnorintranuclearstainingforCRTwasobserved.ConclusionInHSFandNSF,thedistributionofCRTiswidespread.BecauseofitsabundantexpressioninHSF,wepostulatethatCRTasamultifunctionalproteinplaysanimportantroleinCa2 sequestering,integrin-mediatedsignallingandcelladhesion.
【Keywords】HypertrophicscarFibroblastCalreticulinExpression
增生性瘢痕(Hypertrophicscar,HS)作為創(chuàng)傷及外科手術(shù)后常見(jiàn)且十分棘手的皮膚組織疾病，瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞異常活化和細(xì)胞外間質(zhì)過(guò)度沉積既是HS的重要組織學(xué)特征，也是HS發(fā)生、發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin,CRT)最早是作為一種存在于非肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的主要鈣結(jié)合蛋白得以認(rèn)識(shí)的［1］，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)：除具有鈣離子儲(chǔ)藏作用外，CRT在參與并調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞生物學(xué)活性功能上有著積極影響［2-5］，同時(shí)它還作為自身抗原在某些免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中有著極其重要的價(jià)值［6］。我們通過(guò)CRT抗體并利用原位ELISA及免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞體外表達(dá)CRT水平，輔以正常皮膚成纖維細(xì)胞作對(duì)照，探討CRT在瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)揮異常生物學(xué)活性功能中的作用。
1 材料與方法
1.1 組織標(biāo)本
增生性瘢痕及正常皮膚組織標(biāo)本均取自住院病人，年齡17～40歲。患者在取標(biāo)本前無(wú)長(zhǎng)時(shí)間外用各種防治增生性瘢痕藥物史，不伴腫瘤及其他嚴(yán)重疾患；瘢痕組織生長(zhǎng)時(shí)間均在6～9個(gè)月之間。
1.2 主要試劑及物品準(zhǔn)備
羊抗CRT抗體：Michalak博士惠贈(zèng)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM添加10%小牛血清(上海華美生物技術(shù)有限公司)。96孔塑料培養(yǎng)板及100mm培養(yǎng)皿(丹麥Nunc公司)。
1.3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
手術(shù)切取增生性瘢痕及正常皮膚組織，去皮下脂肪，0.01%新潔爾滅浸洗10min，PBS洗3次，用組織剪將組織剪成細(xì)小碎塊并接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃5%CO2靜止培養(yǎng)，3天后補(bǔ)充少量培養(yǎng)劑，隔2天換液，見(jiàn)有細(xì)胞從組織塊爬出生長(zhǎng)后每天換液，傳代。
1.4 CRT免疫細(xì)胞化學(xué)染色
體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞去培養(yǎng)基后，PBS輕洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應(yīng)5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗體37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反應(yīng)1h，DAB顯色；顯微鏡下觀察顯色信號(hào)。
1.5 CRT原位ELISA檢測(cè)［7］
選擇第5代培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)16h
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